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      科普知識
      數(shù)據(jù)分類:
      分光光度計

      微量分光光度計的原理及應(yīng)用如何?

      發(fā)布日期:2022-10-09 點擊率:62

          微量分光光度計能夠快速準確的定量檢測核酸、蛋白質(zhì)等溶液。具有使用方便、消耗樣品少(僅2μl)、不用預(yù)熱、能迅速清理殘留樣品、不需要比色皿或其它樣品定位裝置、樣品不需要稀釋等特點,常用于核酸,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量,目前已成為眾多實驗室的常規(guī)儀器。

       

      光度計.jpg

       

          工作原理


          超微量分光光度計進行濃度測定的原理是根據(jù)朗伯-比爾(Lamber-Beer)定律,A=K·C·L 式中,A為吸光度;K為吸(消)光系數(shù);C為溶液的濃度;L為液層厚度。此公式說明:在入射光一定時,溶液的吸光度與溶液的濃度及液層厚度成正比。此式就是光的吸收定律的數(shù)學(xué)表達式,又叫朗伯-比爾定律。


          核酸定量


          核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率最大的功能。可以定量測定溶于緩沖液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA以及RNA含量。這是由于核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵,具有紫外吸收的特性,最大的吸收波長在260nm,吸收波谷在230nm。


          除了核酸濃度,分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,如A260/A280的比值,用于評估樣品的純度,因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。


          蛋白質(zhì)直接定量


          這種方法是在280nm波長,直接測試蛋白。蛋白質(zhì)直接定量方法,適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說,速度快,操作簡單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。


          比色法蛋白質(zhì)定量


          蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應(yīng),產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。


          比色方法一般有BCA,Bradford,Lowry 等幾種方法。


          與傳統(tǒng)分光光度計相比,超微量分光光度計要求的樣品體積小,不需要比色皿,比色杯清洗方便,只需用干凈的吸水紙將樣品從檢測平臺上擦拭干凈即可。除此之外,實驗過程也更為簡單,不需預(yù)熱,可隨時檢測,檢測結(jié)果顯示吸光度值的同時,程序直接給出濃度值。超微量分光光度計與傳統(tǒng)相比,體積更小,更方便使用。


      標簽:                                    微量分光光度計

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